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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 1537 (2023) Citer cet article

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L'expression de la protéine du cadre de lecture ouvert 1 (ORF1p) de l'élément 1 intercalé long (LINE-1) est une caractéristique commune de nombreux types de cancer, y compris le carcinome séreux de l'ovaire de haut grade (HGSOC). Ici, nous rapportons que l'ORF1p est non seulement exprimé mais également libéré par le cancer de l'ovaire et les cellules tumorales primaires. Les tests de spectrométrie de masse de surveillance des réactions immuno-multiples ont montré que l'ORF1p libéré est détectable en toute confiance dans les milieux conditionnés, l'ascite et le plasma des patients, impliquant l'ORF1p comme biomarqueur potentiel. Fait intéressant, l'expression d'ORF1p est détectable dans les précurseurs épithéliaux des trompes de Fallope (FT) du HGSOC, mais pas dans le FT bénin, ce qui suggère que l'expression d'ORF1p dans un événement précoce du développement du HGSOC. Enfin, le traitement des cellules FT avec des inhibiteurs de l'ADN méthyltransférase a conduit à une expression et à une libération robustes d'ORF1p, validant le rôle régulateur de la méthylation de l'ADN dans la répression de LINE-1 dans les tissus non tumorigènes.

Le cancer de l'ovaire reste l'une des principales causes de mortalité liée au cancer dans les pays développés, représentant environ 180 000 décès dans le monde chaque année1. Aux États-Unis seulement, l'American Cancer Society estime que 19 880 nouveaux cas et plus de 12 810 décès sont survenus à cause du cancer de l'ovaire en 20222,3. Le cancer de l'ovaire est une maladie hétérogène et le sous-type le plus courant est le carcinome séreux de l'ovaire de haut grade (HGSOC)4. La plupart des patients atteints de HGSOC se présentent pour soigner une maladie avancée, auquel cas les rémissions prolongées après le traitement primaire sont rares et les récidives sont marquées par une chimiorésistance croissante. Ainsi, il existe un besoin urgent de stratégies améliorées pour la détection précoce du cancer de l'ovaire afin de réduire la mortalité5,6. Malheureusement, un test de dépistage suffisamment sensible et spécifique qui améliore la survie n'a pas encore été développé. Actuellement, le meilleur outil disponible pour l'évaluation de la maladie ovarienne est l'échographie transvaginale (TVS). Cependant, plusieurs études à grande échelle n'ont pas réussi à démontrer une sensibilité et une spécificité adéquates pour TVS pour justifier son utilisation comme outil de dépistage7,8. Alors que CA-125 et HE4 sont des biomarqueurs bien caractérisés dans le cancer de l'ovaire9,10,11,12,13, leur application clinique est actuellement limitée à l'analyse de l'efficacité thérapeutique et à la détection des rechutes de la maladie14. Les résultats récents de l'étude UKCTOCS (United Kingdom Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening) suggèrent que le dépistage multimodal avec le CA-125 sérique interprété à l'aide de l'algorithme du risque de cancer de l'ovaire (ROCA), l'échographie transvaginale et l'évaluation clinique peut conduire à un passage à un dépistage plus précoce. -détection et traitement du stade15. Malheureusement, le suivi à long terme de l'étude UKCTOCS a montré que la réduction de l'incidence de stade III ou IV observée avec le dépistage multimodal ne s'est pas traduite par des vies sauvées16. Il est important de noter qu'environ 20 % des cancers de l'ovaire ne produisent pas de CA-125 et seraient manqués par une approche dépendant uniquement de ce biomarqueur17. Ensemble, ces résultats renforcent la nécessité d'identifier des biomarqueurs largement applicables qui découlent d'une compréhension plus complète de la biologie de la maladie.

Avec l'évolution des technologies protéomiques, il est possible d'entreprendre une caractérisation systématique des protéines qui sont libérées dans l'espace interstitiel par les types de cellules résidentes dans le microenvironnement tumoral. Le liquide interstitiel tissulaire (TIF) est composé du liquide entre les vaisseaux sanguins et les cellules tissulaires environnantes, constitue 16 % du poids du corps humain et représente une source nouvelle et très prometteuse de biomarqueurs18. Nous avons récemment terminé une analyse à l'échelle du protéome du TIF de l'épithélium normal des trompes de Fallope (FT) et du HGSOC correspondant (Gillette et al., manuscrit en préparation). Parmi les protéines les plus détectées de manière différentielle dans le TIF de HGSOC se trouve la protéine ORF1 de l'élément rétrotransposable de l'élément 1 (LINE-1) longuement intercalée (ORF1p).

Les éléments transposables (ET) peuvent être séparés en deux grandes classes : les transposons d'ADN et les rétrotransposons. Les rétrotransposons sont de loin les ET les plus abondants dans le génome humain et se propagent via des intermédiaires d'ARN qui sont rétrotranscrits et insérés dans de nouveaux emplacements génomiques19. Les rétrotransposons peuvent être subdivisés en deux groupes, qui se distinguent par la présence ou l'absence de longues répétitions terminales (LTR). La grande majorité des ET humains reflètent l'activité présente et passée des rétrotransposons non-LTR, caractérisés par LINE-120,21. Les éléments LINE-1 sont les rétrotransposons codant pour les protéines les plus abondants et les seuls actifs, représentant environ 17 % du génome humain. En gros, 500 000 copies tronquées et 6 000 copies complètes de LINE-1 sont présentes dans le génome humain22. La transcription est pilotée par un promoteur interne de l'ARN polymérase II riche en dinucléotides CpG21,22 mais l'expression dans les cellules humaines adultes est généralement supprimée par la méthylation de l'ADN20. Fait intéressant, la perte de méthylation de l'ADN LINE-1 est un phénotype courant trouvé dans les cancers de l'ovaire et d'autres types de cancer19.

LINE-1 contient deux cadres de lecture ouverts (ORF) : ORF1 code pour une protéine de liaison à l'ARN (ORF1p) et ORF2 code pour une protéine dotée d'activités de transcriptase inverse et d'endonucléase (ORF2p)21,23. L'expression aberrante de l'ORF1p a été documentée dans un certain nombre d'études sur les cancers épithéliaux, y compris l'ovaire24,25,26,27,28,29,30,31, et fait de l'ORF1p un biomarqueur prometteur du cancer. Malgré les niveaux élevés d'ORF1p trouvés dans les cellules cancéreuses, l'expression d'ORF2p n'a jamais été démontrée en utilisant les méthodes standard de détection des protéines32.

Dans la présente étude, nous montrons que ORF1p est non seulement exprimé mais également libéré par HGSOC et les lignées cellulaires tumorales primaires. Nous avons développé des tests d'enrichissement d'immuno-affinité au niveau des peptides (Immuno-MRM, iMRM33,34,35,36,37,38,39,40) combinés à la spectrométrie de masse ciblée pour détecter l'ORF1p sécrété dans les milieux conditionnés, l'ascite et le plasma du patient. échantillons. Nous montrons également que l'expression d'ORF1p est un événement précoce dans le développement de HGSOC, car la coloration ORF1p est présente de manière robuste dans les échantillons de lésions STIC. De plus, ORF1p a été trouvé dans des lésions STIC accidentelles de chirurgies réduisant les risques et sans maladie invasive, validant que la transition de l'épithélium FT normal aux lésions précurseurs de HGSOC est marquée par l'acquisition de l'expression d'ORF1p qui est conservée dans HGSOC avancé. Fait intéressant, nous avons découvert que les agents de déméthylation de l'ADN déclenchent l'expression et la libération d'ORF1p par les cellules FT, validant ainsi expérimentalement la méthylation de l'ADN en tant que mécanisme nécessaire pour restreindre l'expression d'ORF1p dans les cellules FT bénignes.

Les cas de cette étude ont été obtenus auprès des départements de pathologie du Brigham and Women's Hospital et de l'hôpital de l'Université de Pennsylvanie. Des blocs de tissus de trompes de Fallope fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) ont été coupés à partir de 30 cas dont les rapports de pathologie originaux indiquaient la présence de HGSOC. Parmi ces cas, 18 incluaient le diagnostic de STIC et 25 avaient un épithélium FT bénin. Nous avons également obtenu 12 cas de FT bénigne chez des patients dont les trompes ont été retirées pour des raisons non liées au cancer ou au risque de cancer et six cas de lésions accidentelles de STIC (carcinome in situ uniquement) identifiées lors d'une chirurgie de réduction du risque pour les mutations BRCA1/2. Ces lames d'hématoxyline et d'éosine (H&E) ont été examinées par trois pathologistes (MSH, LS, RD) pour confirmer la présence de STIC et éventuellement de carcinome invasif dans les coupes de tissus plus profonds. Les échantillons de plasma utilisés dans cette étude ont été obtenus auprès du dépôt du Dr Steven Skates au Massachusetts General Hospital. Soixante-douze échantillons de plasma de patientes atteintes d'un carcinome séreux papillaire de l'ovaire à un stade avancé (III et IV) (tableau supplémentaire 1) et 37 échantillons de plasma de contrôle ont été analysés.

La coloration immunohistochimique a été réalisée à l'aide du système Envision Plus/Horseradish Peroxidase (DAKO). Des coupes de tissus FFPE ont été déparaffinées, réhydratées et incubées dans une solution de peroxyde d'hydrogène pendant 30 min pour bloquer l'activité de la peroxydase endogène. La récupération de l'antigène a été effectuée à 100 ° C de traitement dans un tampon citrate (pH 6, 0) pendant 20 min. Les coupes ont été incubées avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4°C. L'anticorps secondaire a été appliqué pendant 30 min, suivi de 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) pendant 5 min. Toutes les images H&E et IHC ont été capturées avec le scanner de diapositives Aperio CS2 de Leica BioSystems (Buffalo Grove, IL).

Nous avons utilisé un anticorps monoclonal anti-LORF1 (clone 4H1; Millipore) pour étudier l'expression d'ORF1p. La coloration ORF1p a été notée par deux pathologistes gynécologiques (LES et MSH) à l'aide de l'échelle à 4 niveaux suivante : 0 (toutes les cellules négatives), 1 + (cellules rares dispersées ≤ 10 % de cellules positives), 2 + (coloration focale ou multifocale = 10 -75 % de cellules positives), ou 3 + (coloration diffuse ≥ 75 % de cellules positives). Toutes les taches et les scores ont été examinés par un troisième pathologiste (RD) et dichotomisés en deux groupes : les scores de 0 et 1 + ont été définis comme "ORF1p négatif", tandis que les scores de 2+ et 3+ ont été classés comme "ORF1p positif".

Les cellules ont été cultivées pendant une nuit sur des lamelles de verre. Les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldéhyde/PBS pendant 20 min à température ambiante. Les cellules ont été bloquées avec 3 % de BSA dans du PBS 1X et incubées avec un anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C. L'anticorps secondaire a été incubé pendant 0,5 h à température ambiante. La détection a été réalisée à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à Alexa 488 Fluor Dyes (Molecular Probes ; Thermo Fisher Scientific). Les lamelles ont été montées sur des lames de verre en utilisant un milieu contenant du DAPI. Les cellules ont été analysées par microscopie à l'aide d'un microscope Nikon E400.

Huit lignées cellulaires de carcinome ovarien (KURAMOCHI, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-8, OVKATE, COV318, OVSAHO et CaOV3) ont été utilisées dans cette étude. Toutes les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire, à l'exception de COV318 et CaOV3, ont été cultivées dans du RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Atlanta Biologicals). COV318 et CaOV3 ont été cultivés dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM; Thermo Fisher Scientific) avec 10% de sérum bovin fœtal. Toutes les lignées cellulaires ont été authentifiées à l'aide du profilage Short Tandem Repeat (STR) (IDEXX, Columbus, MO) en 2022 et testées pour être exemptes de Mycoplasma à l'aide du test Cambrex MycoAlert (University of Pennsylvania Perelman School of Medicine Cell Center). L'établissement des lignées cellulaires des trompes de Fallope (FT189, FT194, FT237, FT240 et FT246) a été décrit précédemment41,42. Les cellules FT ont été cultivées dans du DMEM/Ham's F-12 1:1 (Thermo Fisher Scientific) additionné de 2 % de substitut de sérum Ultroser G (Pall Life Sciences). Les cellules HGSOC primaires (lignées cellulaires DF) ont été isolées comme décrit précédemment43. Les cellules DF ont été cultivées dans du Renaissance Essential Tumor Medium (RETM; Cellaria Biosciences) additionné de 5 % de FBS inactivé par la chaleur. Toutes les cellules ont été cultivées à 37 ° C et dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 (voir le tableau supplémentaire 2).

Les lignées cellulaires FT cultivées ont été traitées avec Decitabine (TOCRIS, Cat. #2624) ou SGI-110 (Guadecitabine) (Adooq Bioscience, Cat. #A12744) à une concentration de 5 μM (dans du DMSO) pendant 3, 5 ou 7 jours. Comme témoin, les cellules ont été traitées avec le véhicule seul.

Toutes les cellules ont été cultivées jusqu'à 80 % de confluence. Le milieu a ensuite été remplacé par un milieu sans FBS (lignées cellulaires de carcinome du cancer de l'ovaire) ou substitut de sérum Ultroser G (Pall Life Sciences) (lignées cellulaires FT) et les cellules ont été cultivées pendant 72 h supplémentaires. Le milieu conditionné a ensuite été clarifié par centrifugation et concentré à l'aide d'un filtre centrifuge Millipore Amicon Ultra-15 (Millipore Sigma). La teneur en protéines du milieu conditionné a été quantifiée à l'aide du protocole du kit Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific) et le test Western a été effectué comme décrit ci-dessous.

Des lysats de cellules entières ont été préparés en utilisant un tampon M-PER (Thermo Fisher Scientific). La teneur en protéines du lysat de cellules entières a été quantifiée à l'aide du protocole du kit Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Les protéines (20 à 30 µg) ont été séparées sur une SDS-PAGE à gradient de 4 à 20 % avant d'être transférées sur une membrane PVDF à l'aide du système Turbo Blot (Bio-Rad). Les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C (voir le tableau supplémentaire 3). Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 1 h à température ambiante. Les protéines ont été détectées à l'aide du réactif de détection d'anticorps HRP chimiluminescent Clarity (Bio-Rad) et visualisées avec un système d'imagerie Chemi-Doc (Bio-Rad). Les taches non recadrées pour toutes les figures peuvent être trouvées dans les figures supplémentaires. 1–4.

La méthylation de LINE-1 a été évaluée à l'aide du kit Global DNA Methylation—LINE-1 (Active Motif, Cat. #55017) en suivant les recommandations du fabricant. Le kit LINE-1 est un test basé sur ELISA pour la détection et la quantification des niveaux de 5-méthylcytosine dans l'ADN génomique humain. En bref, les lignées cellulaires FT ont été traitées avec de la décitabine ou du DMSO comme décrit précédemment. Ensuite, l'ADN génomique (ADNg) a été extrait à l'aide du kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Cat. #69504). Un μg d'ADNg de chaque échantillon a été digéré pendant une nuit avec l'enzyme Msel (10 U/μL) à 37 °C. 100 ng d'ADNg digéré ont été hybridés avec la sonde LINE-1 dans un thermocycleur (98 ° C pendant 10 min, 68 ° C pendant 1 h suivi d'une rampe rapide à 25 ° C). La sonde LINE-1 est un oligo biotinylé en 5' conçu pour s'hybrider à une région de 290 pb de l'élément de répétition LINE-1. Cette région contient 88 résidus de cytosine, dont 12 sont dans un contexte CpG. Les réactions ont été préparées en triple exemplaire technique. Les échantillons de PCR ont été transférés sur une plaque revêtue de streptavidine et incubés pendant 1 h à température ambiante avec une légère agitation. Ensuite, une dilution au 1/100 de l'anticorps monoclonal 5-méthylcytosine a été incubée pendant 1 h à température ambiante, suivie d'une incubation de 1 h de l'anticorps secondaire conjugué à la HRP. La solution de développement a été ajoutée et incubée pendant 3 minutes jusqu'à l'ajout de la solution d'arrêt. Enfin, la plaque a été lue à 450 nm. Des échantillons standard d'ADN méthylés et non méthylés ont été préparés en parallèle avec des échantillons traités à la décitabine.

Des milieux conditionnés provenant d'un cancer de l'ovaire ou de cellules épithéliales utérines témoins ont été digérés avec de la trypsine porcine selon notre protocole d'urée décrit précédemment33. En bref, 36 mg d'urée (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à 100 μL de milieu conditionné à une concentration finale de 6 M. Le pH de la solution a été ajusté à 8,0 si nécessaire avec du Tris 1 M pH 8,0. Les protéines ont été réduites avec 6 μL de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) 0, 5 M (Bio-Rad) et incubées 30 min à 37 ° C. Les échantillons ont été refroidis à température ambiante et alkylés par addition de 12 μL d'iodoacétamide (IAA) 0,5 M (Sigma-Aldrich) fraîchement préparé à partir de poudre avant incubation en l'absence de lumière directe pendant 30 min à température ambiante. La concentration d'urée a été diluée à moins de 2 M avec 400 μL de Tris HCl 0,2 M pH 8,1, 2 ug de trypsine (Promega) ont été ajoutés (moyenne 1:50 E:S) et les échantillons ont été incubés sur un thermomixer (Eppendorf) pendant 16 h à 37 °C et 800 RPM. Après 16 h, 2 μg de trypsine fraîche ont été ajoutés et incubés 2 h à 37°C et 800 RPM. Après 2 h, 20 μL d'acide formique pur ont été ajoutés pour stopper la réaction (pH final < 2,5). Les échantillons digérés ont été dessalés séparément à l'aide de cartouches d'extraction Oasis® HLB de 10 mg montées sur un collecteur à vide (Waters). Avant le chargement de l'échantillon, les cartouches ont été humidifiées avec 1 ml d'acétonitrile à 90 %/acide formique à 0,1 % et équilibrées avec 1 ml d'acide formique à 0,1 %. Après le chargement de chaque échantillon, les cartouches ont été lavées avec 3 ml d'acide formique à 0,1 % et les peptides ont été élués dans un nouveau polytube de 1,5 ml en utilisant deux ajouts de 0,3 ml d'acétonitrile à 40 %/acide formique à 0,1 %. Les échantillons ont été séchés par centrifugation sous vide et stockés au sec à - 80 ° C jusqu'à utilisation.

Le liquide d'ascite prélevé sur des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire a été digéré avec du lys'C et de la trypsine porcine selon notre protocole d'urée décrit précédemment34. En bref, 60 μL d'urée 9 M (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à 30 μL de liquide d'ascite (concentration moyenne de protéines 33,7 mg/mL par BCA) jusqu'à une concentration finale de 6 M. Le pH de la solution a été ajusté à 8,0 comme nécessaire avec Tris 1 M pH 8,0. Les protéines ont été réduites avec 6 μL de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) 0, 5 M (Bio-Rad) et incubées 30 min à 37 ° C. Les échantillons ont été refroidis à température ambiante et alkylés par addition de 12 μL d'iodoacétamide (IAA) 0,5 M (Sigma-Aldrich) fraîchement préparé à partir de poudre avant incubation en l'absence de lumière directe pendant 30 min à température ambiante. La concentration d'urée a été diluée à 1,5 M avec 300 μL de Tris HCl 0,2 M pH 8,1. La lysyl endopeptidase (lys-C) (Wako) a été dissoute dans de l'acide acétique 50 mM à une concentration de 0,5 mg/mL et 40 μL ont été ajoutés à chaque échantillon (moyenne 1:50 E:S). Les échantillons ont été incubés sur un thermomixeur (Eppendorf) pendant 2 h à 37°C et 800 RPM. Après 2 h, 10 μg de trypsine (Promega) ont été ajoutés (moyenne 1:100 E:S) et les échantillons ont été incubés 16 h à 37 °C et 800 tr/min. Après 16 h, 10 μg de trypsine fraîche ont été ajoutés et incubés 2 h à 37°C et 800 RPM. Vingt microlitres d'acide formique pur ont été ajoutés pour stopper la réaction (pH < 2,5). Des étalons de peptides lourds (75 fmol chacun) ont été ajoutés à chaque puits de digestion et les échantillons ont été dessalés à l'aide d'une plaque d'extraction Oasis® HLB de 30 mg (Waters) montée sur un collecteur à pression positive (Waters). Les puits ont été lavés avec 1,5 ml d'acétonitrile à 80 %/acide formique à 0,1 % et équilibrés avec 2 ml d'acide formique à 0,1 % en appliquant 15 psi. Un supplément de 0,2 mL d'acide formique à 0,1 % a été ajouté à la cartouche humide avant de transférer les échantillons à l'aide d'une pipette multicanaux. Une fois les échantillons chargés, les cartouches ont été lavées par pression positive (9 psi) avec 3 ml d'acide formique à 0,1 %. Après lavage, les peptides plasmatiques digérés ont été élués avec deux volumes de 0,5 ml d'acétonitrile à 50 %/acide formique à 0,1 % (6 psi). La plaque d'élution a été recouverte d'un film BioExcell® (World Wide Medical Products), congelée et séchée par centrifugation sous vide, puis scellée avec du papier d'aluminium et stockée à - 80 ° C jusqu'à utilisation.

Quarante microlitres de plasma par patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire ont été distribués manuellement dans 96 plaques à puits profonds en trois exemplaires et digérés avec du lys-C et de la trypsine en utilisant notre protocole d'urée adapté à l'automatisation comme décrit précédemment34. En bref, 100 μL d'urée 9 M et 25 μL de TCEP 0,25 M ont été ajoutés aux quadrants 1 et 2 d'une plaque à 384 puits (Greiner) pour chaque puits correspondant d'une plaque à 96 puits contenant un échantillon (Fig. 5A supplémentaire) et placés dans position 7 sur un robot Bravo LT (Agilent) (Fig. 6 supplémentaire). La plaque d'échantillons, les plaques de réactifs, les pointes de pipettes et les plaques de solvants ont été chargées sur Bravo LT, comme illustré à la Fig. 6 supplémentaire. Bravo LT a été recouvert d'un linceul noir personnalisé pour minimiser la pénétration de la lumière et le programme de digestion Bravo a été lancé. Quatre-vingts microlitres d'urée 9 M et 15 μL de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) 0,25 M (Bio-Rad) ont été ajoutés à chaque échantillon et la plaque d'échantillon a été déplacée sur l'agitateur à température contrôlée en position 4 (Fig. 6 supplémentaire ) et incubé 30 min à 37 °C et 800 RPM. L'iodoacétamide (IAA) (Sigma-Aldrich) a été dissous dans du Tris HCl 0,2 M pH 8,1 à une concentration finale de 0,5 M et 50 μL ont été ajoutés dans le quadrant 3 de la plaque à 384 puits en position 7 sur le pont Bravo (Fig. 6). Après 30 min de dénaturation de la protéine TCEP, le robot Bravo a ramené la plaque d'échantillon en position 5 et a ajouté 20 μL d'IAA 0,5 M dans chaque échantillon avant d'incuber 30 min sans mélanger dans l'obscurité. La lysyl endopeptidase (lys-C) (Wako) a été dissoute dans de l'acide acétique 50 mM à une concentration de 0, 5 mg / ml et 100 μL ont été ajoutés au quadrant 1 de la plaque 2 à 384 puits (Fig. 5B supplémentaire). Cent microlitres de trypsine porcine (Promega) formulée dans de l'acide acétique 50 mM à 0, 5 mg / ml ont été ajoutés au quadrant 2 de la plaque 2 (Fig. 5B supplémentaire) et placés en position 6 sur Bravo LT (Fig. 6 supplémentaire). Après 30 min d'alkylation de la protéine IAA, 300 μL de Tris HCl 0,2 M pH 8,1 et 100 μL de lys-C (E:S 1:50) ont été ajoutés. La plaque d'échantillon a été transférée manuellement dans un thermomélangeur hors ligne (VWR) et incubée 2 h à 37 ° C et 800 tr/min. Après digestion lys-C, la plaque d'échantillon a été replacée en position 5 sur le pont Bravo (Fig. 6 supplémentaire) et 48 μL de trypsine ont été aspirés dans chaque puits d'échantillon (E: S 1: 100). La plaque d'échantillon a été transférée manuellement dans un thermomélangeur hors ligne (VWR) et incubée 2 h à 37 ° C et 800 tr/min. Après 2 h, une deuxième addition de trypsine de 48 μL a été aspirée dans les échantillons. La méthode Bravo a ensuite été interrompue et la plaque a été recouverte d'un joint en plastique et incubée 16 h à 37 ° C et 800 tr/min sur un thermomixer hors ligne. Après 16 h, 90 μL d'acide formique à 10 % ont été distribués dans chaque échantillon pour désactiver l'activité enzymatique (concentration finale de 1 %). Des standards peptidiques lourds (150 fmol chacun) ont été ajoutés à chaque puits de digestion et dessalés à l'aide d'une plaque d'extraction Oasis® HLB de 30 mg (Waters) montée sur un collecteur à pression positive (Waters). Les puits ont été lavés avec 1,5 ml d'acétonitrile à 80 %/acide formique à 0,1 % et équilibrés avec 2 ml d'acide formique à 0,1 % en appliquant 15 psi. Un supplément de 0,2 mL d'acide formique à 0,1 % a été ajouté à la cartouche humide avant de transférer les échantillons à l'aide d'une pipette multicanaux. Une fois les échantillons chargés, les cartouches ont été lavées par pression positive (9 psi) avec 3 ml d'acide formique à 0,1 %. Après lavage, les peptides plasmatiques digérés ont été élués avec deux volumes de 0,5 ml d'acétonitrile à 50 %/acide formique à 0,1 % (6 psi). La plaque d'élution a été recouverte d'un film BioExcell® (World Wide Medical Products), congelée et séchée par centrifugation sous vide, puis scellée avec du papier d'aluminium et stockée à - 80 ° C jusqu'à utilisation.

Quatre peptides uniques au produit du gène LINE-1 ORF1p/L1RE1 (LORF1, Uniprot Q9UN81, LORF1_HUMAN) ont été sélectionnés comme immunogènes pour la génération d'anticorps : LTADLSAETLQAR, LSFISEGEIK, LIGVPESDVENGTK et NEQSLQEIWDYVK. Des anticorps polyclonaux de lapin ont été générés chez des lapins blancs de Nouvelle-Zélande selon un protocole standard de 77 jours (New England Peptide) comme décrit précédemment avec des modifications35. En bref, les peptides ont été synthétisés à une pureté de 85 % avec une cystéine supplémentaire sur l'extrémité N-terminale et conjugués à KLH pour l'immunisation. Les peptides ont été combinés et deux lapins ont été immunisés à doses décroissantes sur 70 jours. Les titres d'antisérums des saignements finaux ont été mesurés par peptide ELISA. Deux peptides avec le titre le plus élevé, LSFISEGEIK et LIGVPESDVENGTK, ont été purifiés en série à partir d'un pool de saignements finaux par chromatographie d'affinité en utilisant une colonne Sulfolink (Thermo Fisher Scientific) liée au peptide immunisant. En bref, les sérums ont été liés à la colonne contenant le peptide avec le titre le plus bas ; puis le flux traversant, censé contenir des anticorps spécifiques aux peptides à titre plus élevé ultérieurs, a été lié à la colonne contenant le peptide avec le titre le plus élevé suivant afin de maximiser le rendement pour chaque anticorps. Une fois l'antisérum lié, un lavage prolongé (> 100 CV) a été utilisé pour réduire le peptide passager latent avant l'élution avec un tampon glycine pH 2,5. Les anticorps purifiés ont été dialysés dans 25 % de glycérol/1X PBS/0,1 % de NaN3 et stockés à - 20 °C jusqu'à utilisation.

Vingt microgrammes de chaque anticorps ont été incubés avec des billes magnétiques de protéine G (Thermo Fisher Scientific) à 4 ° C pendant une nuit en utilisant un rapport volume de billes sur μg d'anticorps de 2: 1. Après avoir lavé les billes avec 1X PBS/0,03 % CHAPS, la moitié des billes d'anticorps ont été réticulées en utilisant 20 mM de DMP comme décrit précédemment37. L'efficacité de la capture d'anticorps et la détermination des peptides passagers ont été réalisées en ajoutant des peptides lourds au plasma témoin digéré ou au tampon et en enrichissant à l'aide d'anticorps avec et sans réticulation (voir la section "Enrichissement automatisé de l'immunoaffinité peptidique sur KingFisher"). Des chromatogrammes d'ions extraits de peptides lourds ont été utilisés pour comparer l'efficacité de capture tandis que l'abondance relative du signal de peptide léger a été utilisée pour estimer le pourcentage de peptide passager dans l'anticorps. Des peptides « lourds » correspondants contenant une lysine marquée par un isotope stable à l'extrémité C-terminale ont été synthétisés, purifiés à plus de 95 %, formulés dans 30 % d'acétonitrile/0,1 % d'acide formique et quantifiés par analyse des acides aminés (New England Peptide). Les peptides lourds ont été analysés par LC-MRM-MS en tant que mélange pour les versions "légères" (endogènes) et "lourdes" (standard) du peptide afin de déterminer la quantité relative de peptide non marqué dans le standard de peptide lourd (voir "NanoLC-MRM -Section Analyse MS").

Des échantillons digérés séchés de 100 μL de milieu conditionné, 30 μL de liquide d'ascite ou 20 μL de plasma ont été remis en suspension dans 200 μL 1 × PBS/150 mM Tris pH 8,0/0,03 % CHAPS et mélangés brièvement au vortex à température ambiante avant transfert dans un 250 μL Plaque à puits KingFisher (à l'exception des échantillons de plasma, qui ont été séchés directement dans la plaque à puits). Les peptides ont été extraits à l'aide de billes magnétiques sur le manipulateur de billes magnétiques KingFisherTM par enrichissement par immunoaffinité (IAE) comme décrit précédemment33. En bref, un mélange d'anticorps contenant une quantité optimisée d'Ab par IAE (par exemple 0,5 μg, 1 μg ou 2 μg) a été lié à des billes magnétiques de protéine G de 1 μm (Thermo Fisher Scientific) par mélange par culbutage (Labquake® (Thermo Fisher Scientifique)) en utilisant 2 μL de billes/1 μg d'anticorps pendant une nuit à 4 °C. Les billes d'anticorps ont été lavées deux fois avec 1 × PBS/0,03 % CHAPS, remises en suspension dans un volume équivalent 1 × PBS/0,03 % CHAPS et ajoutées à chaque puits. La plaque a été scellée avec un adhésif en feuille d'aluminium et mélangée doucement au tambour pendant une nuit à 4°C. Après incubation, la plaque a été transférée sur un processeur de billes magnétiques KingFisherTM (Thermo Fisher Scientific) équipé d'une tête d'aimant PCR. Les billes ont été lavées deux fois avec 250 μL de 1 × PBS/0,03 % CHAPS pendant 1,5 min et une fois avec 0,1 × PBS/0,03 % CHAPS pendant 1,5 min. Après lavage, les billes ont été transférées dans une plaque PCR de 100 μL contenant 50 μL d'acétonitrile à 3 %/acide acétique à 5 % pour éluer le matériau lié. Après élution, les billes ont été recueillies dans une plaque contenant 200 μL de PBS 1X/CHAPS 0,03 %/azoture de sodium 0,1 %.

Les échantillons enrichis en anticorps ont été dessalés à l'aide de cartouches AssayMAP Bravo Reverse Phase S (RPS)34. Les éluats de billes d'anticorps dans une plaque PCR Bio-Rad à 96 puits ont été placés sur Bravo en position 6. Les cartouches et les solvants AssayMAP RPS ont été placés sur Bravo comme indiqué dans la Fig. 6 supplémentaire. Les cartouches RPS ont été amorcées avec 50 µL d'acétonitrile à 90 %/0,01 % acide formique à 300 μL/min et équilibré avec 50 μL d'acide formique à 0,1 % à 25 μL/min. Les échantillons ont ensuite été chargés sur des cartouches à 2 μL/min. Les cartouches ont été lavées deux fois avec 50 μL d'acide formique à 0,1 % et éluées avec 50 μL d'acétonitrile à 40 %/acide formique à 0,01 % à 5 μL/min. Les éluats ont été séchés et remis en suspension dans 3 % d'acétonitrile/5 % d'acide acétique avant l'analyse LC-MRM-MS.

Des échantillons dessalés enrichis en anticorps provenant de milieux conditionnés, d'ascites et de plasma ont été analysés sur un spectromètre de masse triple quadripôle TSQ Quantiva installé avec une source Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific) et un système Easy-nLC 1000. La source d'ions a été réglée sur le mode ions positifs avec une température capillaire de 300 C, une tension de pulvérisation de 2 000 et un gaz de balayage réglé sur 0. Le système Easy-nLC 1000 a été amorcé avec la phase mobile A (3 % d'acétonitrile/0,1 % d'acide formique), la phase mobile B (90 % acétonitrile/0,1 % acide formique). Les échantillons ont été injectés (4 μL, 40 % d'échantillon enrichi) sur une colonne PicoFrit ID de 0,075 mm (nouvel objectif) tirée vers un émetteur de 10 μm et emballée sur mesure à 20 cm avec des billes Reprosil de 1,9 μm 200 Å C18-AQ (Dr. Maisch). Le gradient LC était de 5 % B pendant 3 min, 5 % B à 40 % B en 50 min, 40 % B à 90 % B en 2,3 min. Trois transitions ont été surveillées par peptide par MRM programmé en utilisant une fenêtre RT de 8 minutes et un temps de cycle de 1,5 s. Les énergies de collision ont été optimisées sur 4 étapes, 2,5 V par étape dans de plus petits lots non programmés de moins de 500 transitions par lot.

Les chromatogrammes d'ions extraits (XIC) de tous les ions de transition ont été intégrés à l'aide d'un document Skyline (Skyline version 4.1.0.11796 https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view44. L'abondance relative des peptides a été rapportée sous la forme d'un rapport entre la surface des pics légers et lourds.

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.). Les différences d'immunoréactivité ORF1p ou de scores composites entre les ETP, STIC et HGSOC morphologiquement normaux ont été examinées à l'aide du test de Kruskal-Wallis, suivi du test de Dunn pour des comparaisons multiples de groupes. L'analyse statistique des résultats de quantification iMRM a été réalisée à l'aide de MSstats v3.7.3 au niveau des peptides sur les intensités log2 des peptides endogènes pour chaque transition après normalisation au peptide standard marqué avec un isotope stable correspondant. Les données ont été exportées de Skyline et formatées sur mesure pour permettre à MSstats d'analyser les données iMRM séparément par peptide pour chaque protéine. Les zones de pic de tous les échantillons ont été incluses, que des niveaux endogènes de peptide aient été détectés ou non par inspection manuelle des XIC.

L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki. Cette étude a été approuvée par l'Institutional Review Board du Brigham and Women's Hospital (BWH), du Massachusetts General Hospital (MGH), de Boston, MA, et de l'Université de Pennsylvanie (UPenn). Tous les protocoles de prélèvement sanguin ont été approuvés par le Massachusetts General Hospital Institutional Review Board, et tous les sujets ont donné leur consentement éclairé par écrit.

L'expression restreinte de LINE-1 ORF1p au tissu tumorigène a été démontrée dans une variété de cancers, y compris celui de l'ovaire. Étant donné que les protéines spécifiques du cancer peuvent servir de biomarqueurs potentiels, nous avons évalué l'expression d'ORF1p dans le contexte de deux biomarqueurs du cancer de l'ovaire approuvés par la FDA, HE4 et CA-125. Comme prévu, seules les lignées cellulaires cancéreuses exprimaient ORF1p, HE4 et CA-125. En particulier, nous avons observé que chaque marqueur présentait un modèle d'expression unique à travers les différents lysats de lignées cellulaires (Fig. 1A). Par exemple, bien que ORF1p ait été exprimé dans des cellules COV318, ces cellules n'ont pas exprimé HE4 ou CA-125. De même, les cellules OVSAHO exprimaient uniquement HE4 mais ORF1p ou CA-125 négligeable (Fig. 1A). Étant donné que l'expression d'ORF1p est observée dans un large éventail d'échantillons de cancer de l'ovaire et est indépendante de HE4 et de CA-125, nous postulons que l'ORF1p peut servir d'analyte utile dans un outil de dépistage multimodal et multi-biomarqueurs du cancer de l'ovaire.

LINE1 ORF1p est détectable dans les milieux conditionnés de HGSOC et est complémentaire d'autres biomarqueurs connus. (A) Lysats de cellules entières. Expression des protéines ORF1p, HE4 et CA125 (WB) dans les lignées cellulaires FT et HGSOC. Les marqueurs analysés montrent une expression différentielle entre les cellules FT et HGSOC. La vinculine a été utilisée comme contrôle interne. (B) Expression de la protéine ORF1p (WB) dans un milieu conditionné sans sérum de FT et HGSOC. (C) Lysat de cellules entières. Expression de la protéine ORF1p (WB) dans six cellules HGSOC primaires dérivées du liquide d'ascite (cellules DF). La vinculine a été utilisée comme contrôle interne. (D) Expression de la protéine ORF1p (WB) dans les cellules HGSOC primaires dans un milieu conditionné sans sérum.

Pour tester davantage le potentiel d'ORF1p en tant que biomarqueur, nous avons évalué si les cellules cancéreuses de l'ovaire peuvent libérer ORF1p dans les médias. A cet effet, nous avons analysé les milieux conditionnés des cellules en culture. Comme on pouvait s'y attendre, aucune des lignées cellulaires FT n'a publié ORF1p. Au contraire, les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire libèrent un ORF1p facilement détectable, à l'exception de Kuramochi et OVSAHO (Fig. 1B), qui présentaient également une expression plus faible d'ORF1p dans les lysats de cellules entières (Fig. 1A). Pour évaluer si l'expression et la libération d'ORF1p observées dans les lignées cellulaires HGSOC étaient des artefacts de culture cellulaire, nous avons également examiné ORF1p dans des cellules tumorales primaires dérivées du liquide d'ascite de patients atteints de HGSOC avancé (lignées cellulaires DF). En effet, nous avons observé que les six lignées cellulaires DF primaires avaient une expression ORF1p détectable (Fig. 1C) et libéraient ORF1p dans un milieu conditionné (Fig. 1D). Dans l'ensemble, l'expression d'ORF1p est limitée aux cellules cancéreuses et sa libération dans les milieux cellulaires fait d'ORF1p un bon candidat pour étudier son potentiel en tant que biomarqueur.

La libération d'ORF1p par les cellules HGSOC nous a amenés à nous demander si l'ORF1p pouvait être détecté dans les fluides biologiques des patients atteints de la maladie. Pour répondre à cette possibilité, nous avons développé un suivi des réactions immuno-multiples suivi de tests de spectrométrie de masse (iMRM-MS) pour détecter deux peptides qui identifient de manière unique ORF1p (voir la section "Méthodes").

Tout d'abord, pour évaluer les performances du test, nous avons préparé des courbes de réponse dans un fond de plasma standard, en utilisant le signal peptidique endogène présent dans l'échantillon comme référence. Des peptides synthétiques fortement marqués de LINE-1 ORF1p ont été introduits dans 10 μL de plasma digéré allant de 5 amol/μL à 50 pmol/μL en triple exemplaire. En utilisant le programme Quasar dans Skyline pour l'analyse de la courbe de réponse et en supposant un niveau endogène de 1 fmol/μL dans l'échantillon, la limite de détection était de 80 amol/μL pour le peptide LIGVPESDVENGTK et de 280 amol/μL pour le peptide LSFISEGEIK dans le plasma (Fig. .7A et B).

Ensuite, pour évaluer si l'iMRM-MS fournit une lecture similaire de l'abondance relative de l'ORF1p à celle des analyses par Western blot et pourrait être appliquée pour la mesurer dans des fluides biologiques complexes, nous avons évalué l'expression de l'ORF1p par l'iMRM-MS dans des ensembles compagnons de milieux conditionnés à partir de cellules. lignées et cultures primaires de patients. Dans les milieux conditionnés, les résultats de l'iMRM-MS étaient très similaires à ceux que nous avons trouvés dans les Western blots, avec des concentrations d'ORF1p les plus élevées dans les surnageants de cellules COV318 et indétectables dans les surnageants de cultures de cellules FT saines (Fig. 2A). Les milieux conditionnés provenant de lignées cellulaires DF humaines primaires n'ont pas été analysés par iMRM-MS ; cependant, les niveaux d'ORF1p dans les échantillons de liquide d'ascite du patient à partir desquels ces lignées cellulaires étaient dérivées ont été mesurés et détectés dans les six cas (Fig. 2B). Compte tenu des différences substantielles attendues dans la charge tumorale intrapéritonéale et les volumes totaux d'ascite entre les patients, il y avait un degré surprenant de concordance dans les intensités relatives du signal ORF1p entre les surnageants des cultures primaires de HGSOC et les échantillons d'ascite appariés, mesurés par Western blot et iMRM-MS, respectivement (Fig. 1D, 2B). Cependant, les signaux pour DF106 étaient nettement différents, ORF1p était d'un ordre de grandeur plus élevé dans DF106 que les autres échantillons d'ascite mesurés par iMRM-MS (Fig. 2B), tandis que son niveau était à l'extrémité inférieure de la distribution lorsqu'il était mesuré dans le primaire. surnageants de lignées cellulaires par Western blot (Fig. 1D). Néanmoins, les données suggèrent que les niveaux d'ORF1p sont détectables par iMRM-MS dans les fluides biologiques, bien que les résultats de DF106 soulignent que des facteurs supplémentaires peuvent influencer l'abondance mesurée d'ORF1p dans des matrices biologiques complexes.

LINE-1 ORF1p est détecté par iMRM-MS dans les milieux conditionnés, l'ascite et le plasma des patients HGSOC. (A) Les surnageants des lignées cellulaires FT et HGSOC et (B) les cellules HGSOC primaires de l'ascite des patients ont été analysés par iMRM-MS. Le rapport de surface de pic de peptide léger à lourd (PAR) pour la meilleure transition unique a été normalisé à la quantité de protéine dans chaque échantillon. Le PAR pour chaque échantillon a été normalisé par rapport à l'échantillon avec la valeur la plus élevée et rapporté sous forme de pourcentage pour chaque peptide. (C) Rapport de surface de pic de peptide léger à lourd montrant la détection relative et la différence entre les échantillons sains et malades d'une cohorte indépendante contenant 72 cas de HGSOC et 37 témoins sains (N = 109 échantillons de plasma de patients au total).

Nous avons en outre utilisé l'iMRM-MS pour évaluer l'ORF1p à travers les types d'échantillons, y compris la source du signal (cellules STIC ou HGSOC), le liquide d'ascite et la circulation périphérique, en évaluant des ensembles d'échantillons complémentaires provenant de milieux conditionnés par lignée cellulaire (servant de proxy pour la concentration péri-tumorale) et le liquide d'ascite ou le plasma de patients présentant des stades principalement avancés de HGSOC (Fig. 7C – E supplémentaire) (Méthodes et tableau supplémentaire 3). Comme prévu, la quantité de signal MS du peptide ORF1p était inversement corrélée à la concentration de la matrice de fond. L'utilisation d'un enrichissement en anticorps de peptides suivi d'une SEP ciblée a identifié en toute confiance au moins un des peptides ORF1p, LSFISEGEIK, dans environ 10 % des échantillons de plasma, mais avec une intensité de signal 30 fois plus faible que dans les milieux cellulaires conditionnés (2 500 contre 75 000 cps) ( Figure supplémentaire 7E contre 7C). Alors que la dilution du signal de la source à la circulation était probablement un facteur central, la concentration des peptides ORF1p est restée faible même après l'enrichissement en anticorps, probablement en raison de la suppression du signal des peptides de liaison non spécifiques ou de faible affinité avec une abondance endogène beaucoup plus élevée.

Des expériences supplémentaires ont été réalisées pour déterminer si le signal détecté (2500 cps) provenait d'une protéine endogène dans le plasma ou représentait un artefact technique dû soit à un marquage isotopique incomplet du peptide lourd38, soit à un peptide passager dans l'anticorps (peptides liés à l'anticorps polyclonal pendant le processus de génération d'anticorps et de purification par affinité ; voir la section « Méthodes »)35. Comme le montre la Fig. 8A supplémentaire, l'intensité du signal lumineux observé dans un échantillon de peptide lourd était très faible, inférieure à 300 cps, et pour tout signal détectable, le rapport des transitions ne correspondait pas à celui de l'étalon lourd. L'intensité du signal du peptide léger est restée faible et inchangée avec l'enrichissement en anticorps dans le tampon et le plasma témoin et, dans tous les cas, avait un rapport de transition incompatible avec celui du peptide lourd. Ainsi, il n'y avait aucune preuve pour soutenir un artefact dû à des peptides exogènes. Bien que dans le plasma du patient, le rapport de surface de pic léger: lourd d'ORF1p était inférieur à ce qui est généralement considéré comme un rapport quantifiable (0, 007), il était nettement supérieur au signal dans les échantillons de test de contrôle (Fig. 8B supplémentaire).

Enfin, nous avons effectué des tests iMRM-MS sur une cohorte de 109 échantillons de patients comprenant 72 patients cancéreux et 37 patients sains, en un seul exemplaire sur trois jours distincts, en utilisant le cadre statistique fourni dans MSstats (voir la section "Méthodes")46. Comme le montre la figure 2C, il y avait une tendance à des concentrations plus élevées d'ORF1p dans les échantillons de HGSOC par rapport aux témoins, bien que le changement de facteur (log2 = 0, 035) ne soit pas statistiquement significatif.

Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que l'ORF1p peut être détecté en toute confiance dans la circulation sanguine des patients atteints de HGSOC. Néanmoins, d'autres améliorations dans les limites de quantification du test et une population de test plus importante seraient nécessaires pour fournir des estimations quantitatives plus précises de la performance de l'ORF1p en tant que biomarqueur de diagnostic plasmatique.

L'observation selon laquelle ORF1p est exprimé par les cellules HGSOC et détectable dans les fluides biologiques nous a incités à rechercher si l'expression d'ORF1p est un événement précoce ou tardif dans la tumorigenèse HGSOC. Nous avons utilisé l'immunohistochimie (IHC) pour évaluer l'expression d'ORF1p dans des échantillons de tissus de 30 patients diagnostiqués avec HGSOC et 12 témoins sains. Des colorations p53 et Ki-67 ont été réalisées pour identifier les cellules de carcinome et les cellules prolifératives, respectivement (Fig. 3A). Dans les cas HGSOC, un ou plusieurs STIC ont été identifiés dans 18 spécimens, tandis qu'un FTE adjacent et morphologiquement normal était présent dans 25 cas. L'épithélium FT normal était négatif pour l'expression d'ORF1p, tandis que HGSOC était positif de manière diffuse dans presque tous les cas (Fig. 3A, Tableau 1). Le manque d'expression dans l'épithélium FT a été observé dans les cas avec et sans STIC ou HGSOC, suggérant que l'épithélium FT bénin normal est négatif pour ORF1p. L'expression dans HGSOC était généralement robuste et diffuse (Fig. 3A, B) avec une distribution cytoplasmique ou pancellulaire (Fig. 3B). Fait intéressant, lorsque nous avons dichotomisé les scores IHC en groupes négatifs (0 et 1) et positifs (2 et 3), l'expression dans les lésions STIC était robuste avec 14/18 cas montrant une positivité (Fig. 3A, Tableau 1).

L'expression de LINE-1 ORF1p est un événement précoce dans la tumorigenèse du cancer séreux de l'ovaire. (A) LINE-1 ORF1p expression (IHC) dans les tissus de l'épithélium des trompes de Fallope morphologiquement bénigne (FTE), du carcinome séreux intraépithélial des trompes (STIC) et du carcinome séreux ovarien invasif de haut grade (HGSOC). ORF1p abondant est exprimé dans les lésions STIC et HGSOC tandis que le FTE normal est négatif. La coloration p53 identifie les cellules de carcinome et Ki-67 les cellules prolifératives dans le STIC et la tumeur invasive. Toutes les micrographies (objectif 20X) ont été imagées à partir d'un cas représentatif pour aligner l'emplacement des lésions. (B) Distribution cellulaire de ORF1p dans HGSOC. Deux cas représentatifs sont présentés, qui présentent un motif de coloration cytoplasmique et membraneuse (objectif 40X).

Des études génomiques récentes sur les précurseurs du FT et le HGSOC ont montré que dans les cas de HGSOC avancé, la présence de ce qui semble être des STIC dans le FT peut en fait être une maladie métastatique se faisant passer pour un précurseur47,48,49,50. Pour aborder cette possibilité, nous avons coloré six cas de lésions STIC accidentelles résultant de chirurgies de réduction des risques pour l'expression d'ORF1p. Dans ces cas, il n'y a pas de maladie invasive. L'expression d'ORF1p a été détectée dans quatre des six cas. Comme dans les cas avec HGSOC, l'expression d'ORF1p était robuste dans les cellules STIC malignes et non dans l'épithélium FT normal adjacent (Fig. 4). Ces résultats confirment que l'expression d'ORF1p se produit dans les précurseurs FT de HGSOC.

LINE-1 ORF1p est exprimé dans les lésions STIC accidentelles. Images représentatives de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E), de p53 et de l'expression de LINE-1 ORF1p dans l'épithélium des trompes de Fallope (FTE) et les lésions de carcinome séreux intraépithélial des trompes (STIC) (IHC). Les lésions STIC accidentelles affichent une expression ORF1p cytoplasmique et pancellulaire robuste (20X). Il n'y a pas d'expression d'ORF1p dans l'épithélium bénin adjacent. La coloration nucléaire p53 intense est caractéristique de la lésion STIC et est négative dans les tissus normaux. Des micrographies en médaillon (40X) mettent en évidence les cellules ciliées normales dans les FTE bénins et les cellules malignes dans la lésion STIC.

Il est bien documenté que dans les cellules somatiques normales, la méthylation de l'ADN et les mécanismes associés inhibent l'expression du rétrotransposon LINE-1. Dans les cellules néoplasiques, cependant, l'ADN est généralement hypométhylé, ce qui entraîne l'augmentation de l'expression de LINE-1 observée dans une gamme de cancers, y compris celui de l'ovaire26,51,52. Pour évaluer si la déméthylation de l'ADN pouvait induire l'expression et la libération de LINE-1 dans des cellules FT non tumorigènes, nous avons traité quatre lignées cellulaires FT différentes avec l'inhibiteur de l'ADN méthyltransférase (DNMTi) décitabine (5 μM) pendant 3, 5 ou 7 jours. Comme prévu, le traitement à la décitabine a entraîné une déplétion de DNMT1A (Fig. 5A) et une diminution de la méthylation de LINE-1 dans les lignées cellulaires FT (Fig. 5B). En ce qui concerne ORF1p, les quatre lignées FT ont montré une expression robuste d'ORF1p après le traitement, tandis que le DMSO seul n'a eu aucun effet (Fig. 5C). De plus, nous avons testé un DNMTi de deuxième génération, SGI-110 (Guadecitabine), qui a été rationnellement conçu pour résister à la dégradation par la cytidine désaminase et pour prolonger l'exposition des cellules au métabolite actif, la décitabine, assurant une plus grande absorption dans l'ADN de cellules en division53,54. Conformément à nos résultats précédents, le traitement avec 5 μM de SGI-110 a conduit à une forte expression d'ORF1p dès 3 jours après le traitement (Fig. 5D). Un traitement prolongé pendant 5 ou 7 jours a entraîné une amélioration supplémentaire de l'expression d'ORF1p, tandis que le DMSO n'a eu aucun effet (Fig. 5D). La microscopie immunofluorescente a confirmé l'expression d'ORF1p dans les cellules FT traitées par la décitabine par rapport aux cellules FT non traitées. Conformément à la localisation intracellulaire de l'ORF1p dans les HGSOC, l'ORF1p a été trouvé principalement dans le cytoplasme des cellules FT traitées au DNMTi (Fig. 5E).

La perte de méthylation de l'ADN dans les cellules des trompes de Fallope conduit à l'expression et à la détection de LINE-1 ORF1p dans des milieux conditionnés. Les lignées cellulaires FT ont été traitées avec des inhibiteurs de DNMT Decitabine ou SGI-110 (5 µM) pendant 3, 5 ou 7 jours. Le DMSO a été utilisé comme contrôle négatif. (A) Expression de la protéine DNMT1A (WB) et (B) niveaux de méthylation LINE-1 après traitement à la décitabine. Les niveaux de 5-méthylcytosine de LINE-1 dans l'ADN génomique ont été quantifiés et la densité optique (DO) a été mesurée à 450 nm. Une diminution significative des niveaux de DNMT1A et de la méthylation de LINE-1 (N = 3. ***p < 0,0002) a été observée. (C) Expression de la protéine ORF1p (WB) dans les cellules FT après traitement à la décitabine. Aucune des lignées n'exprimait ORF1p avant le traitement mais ORF1p était abondamment exprimé dans toutes les lignées après 5 jours de traitement. La β-actine sert de contrôle de chargement. (D) Comparaison de l'expression de LINE-1 ORF1p dans les cellules FT après un traitement à la décitabine ou au SGI-110 par WB. Les deux composés sont également capables d'induire l'expression d'ORF1p dès 3 jours. (E) Les cellules FT traitées avec Decitabine ou SGI-110 ont été examinées par immunofluorescence pour la présence d'ORF1p (objectif 10X). (F) Expression de la protéine ORF1p (WB) dans un milieu conditionné de cellules FT après traitement avec des agents de déméthylation. COV318 a été utilisé comme contrôle positif pour la libération d'ORF1p.

Enfin, nous avons demandé si le traitement des cellules FT avec decitabine ou SGI-110 favorise la libération d'ORF1p. À cette fin, nous avons traité les cellules FT avec du DMSO, de la décitabine ou du SGI-110 pendant 5 jours et analysé leur milieu conditionné. Conformément à nos données de lignée cellulaire, le traitement des cellules FT avec du DNMTis a conduit à la sécrétion d'ORF1p (Fig. 5F). Ensemble, ces données indiquent que la méthylation de l'ADN est un mécanisme nécessaire pour restreindre l'expression de LINE-1 et la libération d'ORF1p dans les cellules FT.

Le génome humain regorge d'éléments répétitifs entrecoupés qui reflètent l'activité d'éléments transposables. LINE-1 est une telle séquence ; un élément génétique mobile actif chez l'homme qui s'auto-propage et code pour les protéines19,51,55. Les séquences LINE-1 sont non seulement une source importante de variation structurelle héréditaire, mais elles peuvent également conduire à des insertions acquises dans les génomes du cancer19. Nous rapportons ici l'expression d'ORF1p, l'un des produits codant pour les protéines de LINE-1, dans le cancer séreux de l'ovaire de haut grade. Nous utilisons différentes approches pour faire trois observations principales. Tout d'abord, nous montrons que l'ORF1p est exprimé et libéré par les cellules tumorales et les lignées cellulaires HGSOC primaires dérivées de l'ascite et qu'il peut être détecté en toute confiance dans les fluides biologiques, y compris l'ascite et le plasma de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire à l'aide de l'iMRM-MS. Deuxièmement, nous montrons que l'expression d'ORF1p est un événement précoce dans le développement de HGSOC, tel qu'il est exprimé dans le précurseur FT et, en particulier, dans les lésions STIC accidentelles. Enfin, nous montrons que la déméthylation de l'ADN peut activer l'expression d'ORF1p dans les cellules épithéliales FT immortalisées, ce qui est cohérent avec la méthylation de l'ADN agissant comme un mécanisme nécessaire pour supprimer l'expression de LINE-1 dans ces cellules bénignes.

Il a été rapporté qu'un large éventail de cancers expriment LINE-1 ORF1p, y compris les carcinomes rénaux, œsophagiens, pancréatiques, pulmonaires, prostatiques, mammaires et ovariens26,27,29,56,57. Ici, nous rapportons que les cellules cancéreuses de l'ovaire non seulement expriment mais libèrent également ORF1p, ce qui est très pertinent du point de vue du développement de biomarqueurs cliniques. Dans ce contexte, nous avons développé des tests immunoMRM-MS pour détecter les peptides ORF1p protéotypiques trouvés dans le liquide interstitiel tissulaire des échantillons de tissus HGSOC (Gillette et al., manuscrit en préparation). Nous avons utilisé des tests iMRM-MS car cette approche présente plusieurs caractéristiques clés : (1) la mesure des protéines à l'aide d'un format qui prend en charge le multiplexage de haut niveau des candidats biomarqueurs avec un traitement efficace des échantillons ; (2) l'utilisation de réactifs d'affinité (anticorps anti-peptide) augmente l'abondance relative des cibles peptidiques protéotypiques, améliorant la sensibilité analytique de leur détection dans des biofluides complexes couramment collectés et mesurés en clinique (par exemple, le plasma) ; et (3) l'utilisation de la spectrométrie de masse à la place d'un deuxième anticorps fournit une spécificité de séquence, garantissant que la mesure dérive de l'analyte prévu34.

Les tests iMRM-MS ont largement récapitulé les résultats de Western blot dans les surnageants des lignées cellulaires commerciales et primaires. Notamment, l'iMRM-MS a démontré un gradient de signal décrémentiel à mesure que la distance de la source de signal augmentait des échantillons péri-tumoraux à l'ascite au plasma, tout comme cela a été décrit pour les niveaux de CA-125 passant du liquide du kyste ovarien à l'ascite et au plasma chez les femmes avec HGSOC58 . La correspondance générale entre les niveaux relatifs d'ORF1p dans les surnageants de la lignée cellulaire primaire et leurs échantillons d'ascite correspondants suggère que les niveaux différentiels pourraient servir de biomarqueur diagnostique dans les fluides corporels accessibles, mais seuls des tests systématiques dans un grand nombre d'échantillons de plasma de patients HGSOC et des contrôles appropriés peuvent tester de manière adéquate cette hypothèse.

Alors que les résultats de l'iMRM-MS pour les deux dosages de peptides configurés étaient fortement corrélés et les deux fonctionnaient bien dans les surnageants, seul le dosage LSFISEGEIK a détecté l'ORF1p endogène dans les échantillons de plasma des patients. Lorsque des échantillons supplémentaires ont été analysés par iMRM-MS à partir de plasma appauvri en immunoaffinité des protéines plasmatiques les plus abondantes (données non présentées), le nombre relatif d'échantillons où l'ORF1p a été détecté a triplé, pour atteindre environ 30 %. Malgré ces progrès, et bien que la détection dans le plasma puisse être revendiquée en toute confiance, la faible intensité absolue du signal ORF1p et les rapports de surface de pic faible lumière:lourd correspondants empêchent une quantification précise dans ces échantillons. De plus, comme les signaux ORF1p ne sont que légèrement au-dessus du bruit dans les échantillons dans lesquels ils sont détectés, aucune affirmation forte ne peut être faite sur les échantillons dans lesquels ORF1p n'a pas été détecté. Malgré ces limitations, nos résultats contribuent certainement à faire mûrir la mise en œuvre potentielle de l'ORF1p en tant que biomarqueur du cancer de l'ovaire et soulignent la nécessité de tests encore plus sensibles pour l'étude des biomarqueurs plasmatiques.

La quantification de LINE-1 dans les fluides biologiques a fait l'objet d'études dans un certain nombre de publications antérieures, soulignant son potentiel en tant que biomarqueur du cancer. En ce qui concerne l'ADN de LINE-1, l'évaluation de LINE-1 par qPCR dans l'ADN circulant dans les sérums de patientes atteintes d'un cancer du sein s'est avérée utile pour détecter le cancer du sein à un stade précoce59. En termes de méthylation de l'ADN de LINE-1, des études ont montré en utilisant de l'ADN acellulaire (cfDNA), que les échantillons de sérum de mélanome avaient des niveaux de LINE-1 non méthylés significativement plus élevés que le sérum de donneur sain60. De même, l'hypométhylation LINE-1 du cfDNA plasmatique a été proposée comme biomarqueur de progression de la maladie pour le cancer colorectal61. Récemment, une étude a utilisé l'ELISA numérique et la microfluidique des gouttelettes (ddELISA) pour détecter l'ORF1p dans des échantillons de sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein. Cette approche était plus sensible que l'étalon-or actuel pour la détection ultrasensible des protéines62. Ensemble, nos découvertes et les précédentes encouragent l'étude et le développement de LINE-1 et ORF1p en tant que marqueur du cancer de l'ovaire.

Le stade de la transformation néoplasique auquel les éléments LINE-1 sont activés n'est pas clairement compris. Des rapports récents30,31 suggèrent que les contraintes normales sur l'expression de LINE-1 sont perdues au début du développement tumoral. Nos résultats sont cohérents avec ces résultats, car nous avons observé que, bien que l'ORF1p soit négatif dans l'épithélium FT bénin, il est présent dans les lésions précoces non invasives des précurseurs du HGSOC humain (STIC) et maintenu tout au long de la progression du HGSOC. Il est important de noter que l'évaluation de l'expression d'ORF1p dans les lésions STIC accidentelles démontre de manière unique que son expression est une manifestation d'une maladie précoce plutôt que métastatique.

La méthylation de l'ADN des éléments LINE-1 a été postulée comme un mécanisme majeur de suppression dans les tissus adultes normaux. À cet égard, nous avons testé si les agents de déméthylation de l'ADN pouvaient induire l'expression et la libération d'ORF1p dans les lignées cellulaires FT. Pendant la réplication, la décitabine est incorporée dans l'ADN où elle peut piéger de manière covalente les enzymes DNMT, créant des adduits ADN-protéine63, et par la suite la dégradation des DNMT64. Nos données ont montré que le traitement des cellules FT avec des inhibiteurs de DNMT, Decitabine et SGI-110, était suffisant pour déclencher l'expression et la libération d'ORF1p dans un milieu conditionné.

Bien que p53 ait été postulé comme un suppresseur critique de l'expression et de l'activité de LINE-1 dans les cellules humaines somatiques57,65, nos données suggèrent que la déficience en p53 seule ne conduit pas à la dérépression de LINE-1 et à l'expression d'ORF1p. Les lignées cellulaires FT utilisées dans cette étude ont été immortalisées en perturbant la voie p5341,42, FT189 et FT194 ont été immortalisées à l'aide de la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTERT) et de l'antigène T SV40, tandis que FT237 et FT240 ont été immortalisées sans oncoprotéines virales, et aucune de ces les lignes expriment ORF1p. De plus, nous et d'autres n'avons pas détecté l'expression d'ORF1p dans les premières lésions des trompes de Fallope qui hébergent des mutations de TP53, connues sous le nom de p53 signature30,31, suggérant l'implication de mécanismes de régulation supplémentaires.

En résumé, ORF1p semble être exprimé de manière unique par les cellules cancéreuses de l'ovaire par rapport aux cellules des trompes de Fallope. La présence d'ORF1p dans les lésions STIC accidentelles indique que son expression est un événement précoce de la tumorigenèse. L'expression binaire apparente d'ORF1p est régulée par la méthylation de l'ADN qui est perdue lors de la transformation néoplasique et contribue à la libération d'ORF1p dans les fluides biologiques. Bien que des tests plus sensibles soient nécessaires, la détection fiable de l'ORF1p dans les fluides biologiques du plasma des patients soutient son développement ultérieur en tant que biomarqueur candidat du cancer de l'ovaire.

De plus amples informations et demandes de ressources et de réactifs doivent être adressées au contact principal, le Dr Ronny Drapkin à [email protected]. Cette étude a généré de nouveaux anticorps peptidiques LINE-1 ORF1p.

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Nous tenons à remercier les membres des laboratoires Drapkin, Burns et Carr pour leurs discussions fructueuses, Alexandra Cocco pour son aide à l'évaluation des anticorps et des réactifs peptidiques standard utilisés dans les tests iMRM, Sebastian Vaca avec l'analyse MSstats des données iMRM, Mei Zheng pour l'immunohistochimie, le Dr Adam Karpf (Université du Nebraska) pour une discussion utile et le Dr Andrew Godwin pour sa généreuse provision de cellules épithéliales de surface ovarienne.

Ce travail a été soutenu par un programme de bourses de chercheur mentoré de l'Ovarian Cancer Research Alliance (891470 à PRdS), le China Scholarship Council (YF), le Skacel Family Scientific Scholar Award du Rivkin Center (SMG), le National Cancer Institute EDRN 5U01CA152990 (sous-subvention 217321 pour les années 1 à 5 et 227914 pour les années 6 à 8) (RD, MB, SC, SS, MG), NCI SPORE in ovarian cancer P50 CA228991 (RD), l'Honorable Tina Brozman Foundation for Ovarian Cancer Research ( RD), la Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (RD), la Claneil Foundation (RD), la Run and Walk for Family and Friends with Cancer (RD), Shooting for a Cure (RD), Maggie's Memorial Fund (RD), le Helene Ross Bogutz Fund for Ovarian Cancer Early Detection (RD), le Marjorie S. Stanek and Lowell H. Dubrow Ovarian Cancer Research Center Endowed Fund (RD), le Basser Center for BRCA (RD) et le Fondation Mike et Patti Hennessy (RD).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Sho Sato et Michael Gillette.

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Sho Sato, Pamela R. de Santiago, Yi Feng, Sara Hobday, Marilyn A. Mitchell, Kai Doberstein, Stefan M. Gysler et Ronny Drapkin

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Lauren Schwartz

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Michael Gillette, Michelle S. Hirsch, Steven J. Skates, Kathleen H. Burns et Steven A. Carr

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Ronny Drapkin

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SS, MG et RD ont conçu le projet et le plan expérimental. SS, EK, YF, PJI, MAM, MG, PRdS., SH, SMG, CMD, KHB et RD ont mené des expériences et analysé les résultats. EK, MB, KD, PJI, MG et SAC ont développé, réalisé et analysé les expériences protéomiques. MSH, LS et RD ont fourni une expertise des tissus et de la pathologie. SS a fourni des échantillons de plasma et un soutien statistique. Tous les auteurs ont participé à la rédaction et à la révision du manuscrit. RD a servi de superviseur général de l'étude.

Correspondance avec Ronny Drapkin.

R. Drapkin siège au conseil consultatif scientifique de Repare Therapeutics et de VOC Health. Aucun des autres auteurs ne déclare d'intérêts concurrents.

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Réimpressions et autorisations

Sato, S., Gillette, M., de Santiago, PR et al. LINE-1 ORF1p en tant que biomarqueur candidat dans le carcinome séreux de l'ovaire de haut grade. Sci Rep 13, 1537 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

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Reçu : 16 août 2022

Accepté : 25 janvier 2023

Publié: 27 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28840-5

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